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分子荧光光谱实验报告
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原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。以物质发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行定量分析及以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行定性分析的方法称为荧光分析法。在荧光分析中，将荧光分为自然荧光和人工荧光，本实验所述荧光为自然荧光，即无须经过处理，当受到激发光照射时就能产生荧光的现象。
一、实验目的
理解并掌握荧光产生的机理。
学会测定不同浓度物质溶液的荧光激发光谱和发荧光射光谱。
了解影响荧光产生的几个主要因素。
二、实验原理
原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。
1、产生过程（如图1）
光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态。此时，荧光分子处于激发态。
内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射跃迁过渡到低的能级。 外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的作用，以及能量转移，过渡到低的能级
荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命约为10ns左右。
系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间。
2、光谱特性
激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线 。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。
发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波长的关系。
1) Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
2) 发射光谱的形状与激发波长无关：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。
3) 镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。
4) 荧光寿命和荧光量子产率。
去掉激发光以后，荧光强度并不是立即消失，而是以指数形式衰减。定义荧光强度降低到激发状态最大荧光强度的1/e所需要的时间称为荧光寿命。荧光寿命是个很重要的参数，可以不再对荧光的绝对强度进行测量。
荧光寿命方程：
Q为量子产率，为荧光发射速率，k为非辐射转移速率,τn为荧光自然寿命、通常量子效率和波长相关，但生化的荧光通常和波长无关。
3、影响荧光分析的几个主要因素：
样品温度的影响：降低体系温度可以提高荧光量子产额。 样品的光化反应：光化反应使荧光强度降低。 杂散光干扰：散射光来自激发光溶剂分子的散射（瑞利散射）或被小颗粒或气泡的散射。通过在发射单色仪前和激发单色仪后插入相应的短波截止滤光片来消除。 溶剂的影响：增加溶剂的极性，有利于荧光的产生。 溶剂的拉曼散射光：当溶剂具有拉曼活性时，在激发光长波边会出现类似荧光的拉曼散射峰。 样品浓度效应：浓度高时荧光强度下降，需要校正。 样品污染的影响：轻微的污染都会影响测量的准确度。 溶解氧的影响：溶解氧对一定样品有明显的荧光消光效应（猝灭）。 pH值的影响：弱酸或弱碱分子和它们的离子在电子构型上不同，是不同的型体，各具有特殊的荧光量子产额和荧光光谱
三、 实验内容和装置
激发单色仪将氙灯输入的连续光谱分理出单色光输出，作为激发光。激发光照射到样品上，样品发射的荧光则由发射单色仪进一步分光并被光电倍增管PM2接收。PM1用于监控氙灯光源光强起伏。通过分束器获得激发光强起伏信号，并反馈到PM2电路中，这被称为光源补偿系统。RF-5301PC型分光光度计的光学系统示于图3。
实验步骤：
1、 制备样品：配置不同浓度维生素B2溶液：5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，20μg/ml，25μg/ml各10ml；
2、 样品的激发光谱特性：选择400nm激发波长，对样品照射，然后扫描荧光发射波长，检测荧光发射峰值波长。然后将单色仪固定于峰值波长上，对激发波长进行扫描，得到激发光谱图像；
3、 样品的发射光谱特性：激发光波长设置在激发光谱的峰值波长处，对被测样品照射，扫描荧光发射波长。
四、数据处理和分析
1、 维生素B2溶液浓度为5μg/ml
2、 维生素B2溶液浓度为10μg/ml
3、 维生素B2溶液浓度为15μg/ml
4、 维生素B2溶液浓度为20μg/ml
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